ما هو تخليق الببتيد

 

يعد تخليق الببتيد مجالًا نشطًا في كيمياء البروتين والببتيد، والذي يتضمن عادةً الإضافة المتسلسلة للأحماض الأمينية بترتيب محدد لتشكيل سلسلة الببتيد بالطرق الكيميائية. طرق التوليف الرئيسية هي تخليق الطور السائل والمرحلة الصلبة. بالمقارنة مع LPPS، يتمتع SPPS بمزايا كونه أسرع وأبسط مع تفاعلات جانبية أقل وإنتاجية أعلى.

 

طريقة SPPS القياسية، بما في ذلك استراتيجيات Boc (البنزيل) وFmoc (tBu).

 

 

استراتيجية Boc (البنزل).

في هذا النهج التوليفي، يتم استخدام راتنجات الكلوروميثيل والبوليسترين الهيدروكسي ميثيل والبي ميثوكسي بنزيل (PMA) كدعامات صلبة. تتم حماية المجموعة -amino باستخدام t-butoxycarbonyl (Boc)، في حين تتم حماية مجموعات السلسلة الجانبية من الأحماض الأمينية بمشتقات البنزيل. تتم إزالة مجموعة Boc باستخدام TFA أو TFA الأنيق في CH2Cl، وفي نهاية التوليف، تتم إزالة مجموعات حماية السلسلة الجانبية وروابط الببتيد-الراتنج باستخدام حمض قوي مثل حمض الهيدروفلوريك اللامائي (HF) أو TFMSA.

 

استراتيجية Fmoc (tBu).

في هذا النهج التخليقي، يتم استخدام راتنج وانج، 2-راتنج كلوريد كلوروتريتيل، راتنجات رينك أميد-AM، راتنجات رينك أميد-MBHA كدعائم صلبة. المجموعة الأمينية محمية بـ 9-فلورينيل ميثوكسي كربونيل (Fmoc). )، في حين أن مجموعات السلسلة الجانبية من الأحماض الأمينية محمية بمجموعات حماية ذات علامات حمضية. تتم إزالة مجموعة Fmoc باستخدام 20% بيبيريدين في DMF، وفي نهاية التوليف، تتم إزالة مجموعات حماية السلسلة الجانبية وروابط الببتيد-الراتنج مع 1% -95% TFA. يعتبر Fmoc SPPS حاليًا الطريقة المفضلة لتخليق الببتيد.

 

المبادئ الأساسية لتخليق الببتيد في المرحلة الصلبة Fmoc

 

اختر الراتنج

الراتنجات الأكثر تطبيقًا على نطاق واسع في Fmoc SPPS بما في ذلك 4-راتنجات كحول ألكوكسي بنزيل (وانغ)، 2-راتنجات كلوريد الكلوروتريتيل، راتنجات Rink Amide، راتنجات Rink Amide-MBHA. تُستخدم راتنجات الأميد في تخليق الببتيدات مع وسط طرفي C مطلوب. يتم استخدام راتينج Wang و2- Cl Trt بشكل شائع لتخليق الببتيد مع COOH المطلوب من طرف C. ولكن عندما يكون الطرف C من الببتيد يحتوي على Pro وGly كأول حمض أميني، فلا ينبغي استخدام راتنج وانج بسبب خطر تكوين DKP (ديكيتوبيرازين)، 2- يوصى باستخدام راتنج كلوريد الكلوروتريتيل.

 

 

ربط الأحماض الأمينية المحمية بالراتنجات

يتم ربط أول حمض أميني Fmoc براتنج داعم غير قابل للذوبان عبر رابط حمضي قابل للتغيير.

 

إلغاء حماية مجموعة الحماية الأمينية

تتم إزالة مجموعة الحماية المؤقتة Fmoc عند الطرف N من راتينج الببتيديل عن طريق معالجتها بمحلول بيبيريدين 20% في DMF. عادة ما ينتهي هذا التفاعل خلال 10 إلى 20 دقيقة.

 

خطوات الغسيل

بعد كل تفاعل كيميائي، يتم تنفيذ خطوات الغسيل لإزالة الكواشف الزائدة والمنتجات الثانوية والجزيئات غير المتفاعلة من الراتنج. وهذا يساعد في الحفاظ على نقاء سلسلة الببتيد المتنامية.

 

تفعيل واقتران الأحماض الأمينية المحمية

يتم تنشيط الحمض الأميني المحمي المرتبط بالراتنج لتعزيز تفاعله للاقتران مع الحمض الأميني التالي في التسلسل. تشمل عوامل التنشيط الشائعة HOAt وHOBt وPyBOP وPyAOP وHBTU وHATU. يتضمن الاقتران تكوين رابطة ببتيدية بين الحمض الأميني المنشط والمجموعة الأمينية لسلسلة الببتيد المتنامية. عادةً ما يُستخدم اختبار كايزر لمراقبة اكتمال تفاعلات الاقتران.

 

خطوات الغسيل

على غرار خطوات الغسيل السابقة، يضمن هذا إزالة الكواشف الزائدة والمنتجات الثانوية بعد تفاعل الاقتران.

 

الانقسام من الراتنج وإزالة حماية مجموعات حماية السلسلة الجانبية

بمجرد تصنيع تسلسل الببتيد المطلوب على الراتينج، يتم فصله من الدعامة الصلبة باستخدام كوكتيل الانقسام مثل حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) الذي يحتوي على مواد زبالة مثل الثيوانيسول والماء. في الوقت نفسه، تتم إزالة مجموعات حماية السلسلة الجانبية الموجودة على بقايا الأحماض الأمينية، مما يكشف عن الببتيد المنزوع الحماية بالكامل والجاهز للتنقية والتحليل.